α-法尼烯是重要的倍半萜类次生代谢物质,具有许多重要的生物学效应。α-法尼烯是果实中主要的香气成分之一,与昆虫的诱导产卵有关。α-法尼烯是诱导虎皮病发生的重要因素,虎皮病是梨、苹果在低温贮藏的中后期发生的最严重的生理病害之一。果皮中α-法尼烯的生物合成是通过类异戊二烯途径中的甲羟戊酸途径,在此途径中调控α-法尼烯合成的酶主要包括HMGR、FPPS、α-法尼烯合成酶。其中α-法尼烯合成酶是调控α-法尼烯合成的关键酶,它催化FPP转变为α-法尼烯。近年来,通过α-法尼烯合成酶来研究虎皮病的分子机制已经成为国内外研究的热点。 鸭梨属于白梨品系,中国是鸭梨的主要产地。为研究α-法尼烯合成酶基因的功能,本实验采用改良的CTAB-LiCl法从鸭梨中提取RNA,根据GenBank注册的α-法尼烯合成酶基因序列设计特异引物,通过同源克隆途径分离了α-法尼烯合成酶基因的编码区序列及3’片段序列,通过酶切和连接等分子生物学手段构建了反义、RNAi中间表达载体,并通过冻融法将载体转化农杆菌,并用于遗传转化研究。主要结果如下: 1采用改良的CTAB-LiCl法从鸭梨中提取了高质量的RNA,经过RT-PCR扩增得到了1824bp鸭梨α-法尼烯合成酶基因(PFS)(GenBank注册号:DQ364626)。 2序列分析发现该cDNA包含一个由1728个核苷酸组成的开放阅读框架,编码分子量约66KDa的576个氨基酸残基的蛋白质。序列相似性分析结果表明,它与苹果中克隆得到的α-法尼烯合成酶(AFS)基因具有很高的同源性,与来源于黄瓜、杉树、松树的α-法尼烯合成酶基因的同源性较低。且具有两个典型的与酶功能相关的萜类合成酶基因保守结构域:位于N端的RRX8W(33-43)和C端的DDXXD(326-330)。系统进化树分析表明鸭梨PFS基因属于萜类合成酶Tps b家族。 3应用Northern杂交技术和高效液相技术(HPLC)分别检测了该基因在不同部位的表达和α-法尼烯的释放情况,PFS基因在鸭梨果皮中的表达量最大,叶中的次之,茎、花、根中的表达量相对较少。且PFS基因的表达与α-法尼烯的积累具有高度的协同性。 4为了获得鸭梨突变体转基因植株,转录后能有效抑制PFS基因的表达,利用RT-PCR技术从鸭梨的果皮中获得了来源于α-法尼烯合成酶基因(PFS)编码区的两个基因片段,反向连接,经PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定,验证其序列和设计的相一致,成功构建了抑制α-法尼烯合成酶基因表达的RNAi表达载体PBI-L-S。 5成功构建了反义表达载体PBI-PFS-L,然后借助农杆菌介导法转化鸭梨。