文章来自“科学大院”公众号
作者： 李辉
开篇词：
放线菌能产生抗生素，酿酒酵母能酿出美酒、藻类还能生产被誉为脑黄金的DHA……小小的微生物，能够生产出各种各样化合物，变成人类社会中的健康守护者（药品）、能量之源（燃料）、情绪催化剂（酒精）……而如果有了生物工程师的介入，微生物可以变得更强，“变身”成“细胞工厂”，为人类谋求更大的福利。
先进的微生物细胞工厂，可以让人类获得更加廉价的化学品。而工程师的技术越先进，某种程度上代表国家在生物技术领域的竞争力越强。
那么，工程师是如何打造微生物细胞工厂呢？各个环节会使用到哪些新技术？现在真的已经有这样的细胞工厂了吗？大院er和生物工程师们推出了微生物“智”造专题，我们将为你讲述这些“工厂”里的故事。
中国科学院有一位“亿元教授”，在国外完成学业后回国组建实验室。他开发出一种比较先进的能够产L-丙氨酸的“工厂”。技术转让后，企业迅速凭借他打造的“工厂”打败诸多跨国大企业，将自己的市场占有率从18%提高到80%，也带动形成一个全新的产业链。而随着企业的上市，这位老师也顺利跨入了“亿元教授”俱乐部。同时，从生产者到消费者，很多人也因为这个工厂而受益（对此感兴趣的小伙伴可以搜索第一条参考文献~）。
上面说到的“工厂”是啥？
区别于我们一般认知中的工厂，这类“工厂”它其貌不扬，没有大烟囱，也没有机械化的流水线，“占地”仅仅在零点几到几百微米之间，但是它们的产品却是千家万户生活中的必备之物，谁拥有了建造这些工厂的先进技术，谁就拥有了更强的造福社会的能力以及源源不断的财源。
这里所说的“工厂”其实是微生物。微生物之所以能够被当作“细胞工厂”，一是因为它们能够产生各种各样对人类有益的化学品，而这些化学品目前已被广泛应用到了包括食品、药品、农业及能源等众多领域，二是因为存在一些可以被称作生物工程师的人，这些人的工作就是去创造或强化微生物生产化学品的能力，正是他们的存在，才使得微生物对人类有益的特性能够被无限放大，从而对人类社会产生实质性的影响。
微生物所产化学品的应用（从上到下依次为调味品、药品、化妆品原料、能源丨图片来源：海天、Veer图库）
既然微生物细胞工厂这么多金，那要靠它走上致富的道路需要经历什么呢？以下的这六个阶段是必经之路。
第一阶段：利润和能力的匹配
建造微生物细胞工厂，面对的第一个问题是用它产什么化合物？
单纯从赚钱策略的角度来看，细胞工厂所产的化合物可以分为两类。
一类是薄利多销型化合物，又称作大宗化学品，这类化学品的特点是结构简单、价格低廉并且社会和市场对它们存在巨大的需求，比如能被用作燃料的乙醇和丁醇就是其中典型的例子。
另一类是“一单回本”型化合物，又称作精细化学品，这类化学品结构复杂、价格昂贵，且一般没有成熟的化学合成路线或合成成本太高。这类产品通常被应用于医药或者化妆品领域，来源于马达加斯加长春花中的长春新碱就是一个典型的例子，长春新碱是一种潜在的抗癌化疗药物，从长春花中提取一盎司（28.3g）的量就需要一吨的长春花，花费将近100万人民币。
长春花及长春新碱（图片来源：Veer图库、维基百科）
第二阶段：让合适的微生物去产正确的化合物
选好产品之后，接下来的第二个问题是把目标化合物放到哪种底盘微生物中去生产？其实挑底盘微生物这件事，优秀的工程师和优秀的教师的理念有相似之处，好的老师会对不同的学生因材施教，而好的工程师也懂得选择合适的微生物去生产它所擅长生产的化合物，他们能够凭借两方面的经验选出合适的底盘微生物。
一方面是对不同微生物先天优势的了解，比如梭菌（Clostridium sp.）比较适合生产可以用作化工原料的丙酮和丁醇；棒杆菌属（Corynebacterium sp.）的微生物比较适合生产氨基酸；不透明红球菌（Rhodococcus opacus）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）适合生产脂类、脂肪酸和其衍生物；而放线菌（Actinomycetes）则适合生产抗生素和聚酮类化合物。
从上到下依次为梭菌、棒杆菌、解脂耶氏酵母、放线菌（图片来源：Science Photo Library及Marizeth Groenewald et al., 2014）
另一面是对不同微生物安全性的了解。有些由微生物产生的化学品是会直接被人类食用或者使用的，比如日常生活中的调味品和会直接涂抹到肌肤表面的化妆品。如果要生产这类化合物，工程师一般则会选择所谓的公认安全（GRAS：generally recognized as safe）的微生物作为底盘：酿酒酵母（S. cerevisiae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、谷棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)、 乳酸菌（Lactic acid bacteria）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida KT2440）都是比较有名气的GRAS微生物。
三种明星GRAS微生物（从上到下依次为酿酒酵母、芽孢杆菌、乳酸菌丨图片来源：维基百科、American Biosystems、2018 Dr.Horst Neve）
第三阶段：设计化学品的“生产线”
底盘选好就可以设计针对目标化合物的生产线了，所谓生产线，就是生产原料经微生物代谢后转化成目标化合物的途径，这些代谢途径的设计，根据难易程度的不同可以分成三个级别：
入门级设计的理念是没有设计，在这种情况下所选的底盘中恰好就有能产目标化合物的代谢途径，比如酿酒酵母本来就能将葡萄糖转化成乙醇，用它产乙醇，在开始阶段就不用费太多精力。
中级设计的理念是“移花接木”，其实也就是从其它物种中“抄答案”，借鉴得越多，对工程师的技术要求越高。
前两年，首尔大学的工程师们想用酿酒酵母去生产一种能吸收紫外线的化合物-类菌孢素氨基酸（MAA），酿酒酵母自己本身不能生产MAA，但蓝细菌可以。于是她们利用基因编辑技术，把蓝细菌中的四个基因人为的在酿酒酵母中表达，就和酿酒酵母中已有的代谢途径一起搭建起了完整的MAA合成途径。
而困难版的“移花接木”，往往需要更广泛的借鉴，比如斯坦福的工程师们曾经在酿酒酵母中设计并搭建出了本来只存在罂粟中的阿片类药物生产线，在搭建的过程中，她们总共向酿酒酵母中表达了多达20多个来源于植物、哺乳动物、细菌以及酵母菌本身的基因。
用7个物种来源的基因在酿酒酵母体内设计并搭建的阿片类药物合成途径（图片来源：中科院植物所北京植物园、 Science Photo Library、维基百科、Stephanie Galanie et al.,2015）
高级的设计理念是“无中生有”，专业化的表述叫做“反向合成”，这个策略适合那些结构复杂，生物合成途径不清楚的化合物。
其大致过程是将复杂化合物可能的前体通过枚举的方式列出来，再将其前体的前体列出来，重复这个步骤，直到列出的化合物是一个足够简单的化合物。此时会得到很多条从简单到复杂的合成途径，接下来就是寻找最优途径，找到后设计就算是完成了。
反向合成原理（图片来源：Centre for Molecular and Biomolecular informatics）
第四阶段：让微生物细胞工厂更“皮实”
微生物细胞工厂作为有生命的个体，由于需要承受来自工程师的厚望，一般工程师会希望它们能够“皮实”一些，对环境中的抑制因子不要过于敏感，比如希望它们在高效生产目标化学品的同时，还能够抵抗生产过程中浓度产物对微生物的毒性等影响。
为了让微生物变得更皮实，工程师一般会采用两种手段：
如果对目标化合物产生毒性的分子机制很了解，工程师一般会对底盘微生物进行针对性的改造。比如：如果微生物分泌到细胞外的化合物再次回到细胞内会对微生物有毒性时，工程师可以通过改造微生物，来堵死这种有毒化合物进入细胞的途径；再比如目标产物在细胞内浓度过高也会抑制微生物的生长时，增强微生物的对该化合物的转出能力就是一种很好的解决策略；
如果对化合物毒性产生的机制不甚了解，工程师往往会采取简单粗暴的筛选加改造。
这种方法叫做实验室适应性进化，就是把微生物放到含有毒性化合物的培养基中不断的传代，传代过程中同时也逐渐增加毒性产物的浓度，最后在毒性化合物浓度最高的培养基中存活下来的微生物会被选择出来，然后从基因组水平上去检查它与之前有什么不同，找到能够赋予抵抗毒性的关键突变，然后再对正常的微生物定向改造，即可获得具有抗性的微生物。
不同条件下对微生物进行连续的驯化（图片来源：Choi, K.R., et al., 2019）
第五阶段：优化“生产线”
评价一个微生物细胞工厂产化合物的过程是否有竞争力主要看三个参数，分别是：滴度（Titer），即目标产物的浓度；收率（Yield），即所得到每克目标化合物和所投入每克原料的比值；生产率（Productivity），即单位时间、体积或者单位细胞所生产目标产物量的比率。一般而言，这三个参数是越高越好，所以如果想要足够高的效率和利润，光有目标产物的代谢途径是不够的，还需要对“生产线”也就是代谢途径进行优化，确保生产目标产品的生产线能在微生物中更高效的运行。
细胞内主要的代谢途径（图片来源：2003 International Union of Biochemistry and Molecular Biology）
对微生物有一些了解的人会知道，它们细胞内部的代谢途径其实是由很多条代谢途径组成的复杂代谢网络，只有对代谢网络的复杂性具有足够的认识，改造起来才事半功倍。
目前，工程师可以方便的从基因组、转录组和代谢组等多种组学水平去理解细胞内的代谢网络。对细胞内代谢网络有了全貌性的了解之后，工程师就有底气对内源的代谢途径做修改了，修改这些内源的代谢途径的指导原则主要是“开源节流”，即为增加目标化合物前体的供应并避免目标化合物转化成其它化合物。
第六阶段：微生物细胞工厂的放大
对于工程师而言，前五个阶段如果都能顺利完成，也不一定能拿到钱，还需要一个从实验室走向生产的关键过程——微生物细胞工厂的放大。
微生物细胞工厂的放大过程（来源：Yoo-Sung Ko et al., 2020）
工程师构建好微生物细胞工厂后往往只会在实验室对它进行性能测试，实验室培养细胞工厂的规模往往在数百毫升到30升之间，测试性能达标后，还会在中试规模继续进行验证，中试规模培养微生物的反应器容积往往在30到3000升之间，但这样的规模相对于实际需求还是太小。
更大规模的实验一般会由企业来做，先经历一个规模在3000到20000升的工艺验证阶段，仍然没有问题后，就可以在20000到2000000升的运行规模中正式上岗，发光发热了。
如何能够成为生物工程师？
这六个阶段都结束后，短期来看，开发工厂的工程师和企业可能会在大赚一笔，能够填补由于前期研发“砸钱”消耗的元气；长期来看，如果工程师和企业联手能创造出更好、更有意义的的微生物细胞工厂，那么同样的成本，产物供应量相应上升，最终消费者购买的价格则会有所降低。所以打造微生物细胞工厂，无论对生产者（工程师、企业）还是消费者（社会）都是具有重大意义的。不过就成本来看，目前要建这样的“工厂”还是有很大的挑战，新的技术是降低成本和缩短周期的关键，接下来的文章里会对一些先进生物技术进行深度解读。
有些小伙伴看到生物工程师靠微生物细胞工厂走上致富之路，就也想效仿？
等等，你可千万别急着入行，不妨再来看看你个人需要经历些什么才能靠这种模式赚钱吧！
首先需要经历系统、专业的训练，至少获得一个与生物学相关的博士学位，成为一个优秀的博士，对以上六个阶段了然于胸的同时还得是某个细分领域的专家。在经过调研确定下来一个有市场前景自己也能做的来的化合物之后，你还得能组织起一个拥有在这六个阶段都有所长的研究人员的团队，之后你的团队可能还需要几年的时间去攻关从微生物细胞工厂构建到大规模应用所面临的所有问题，整个过程中你还需要充足的资金作为物质基础，这笔钱的数额大概会超过千万美元。以上人力、物力及时间的成本是目前构建出一个在经济上有竞争力，能满足工业化生产需求的微生物细胞工厂所需成本的平均水平。
亲爱的读者朋友们，了解完生物工程师建造微生物细胞工厂的过程，你有什么的期待和担心，不妨在评论区告诉我们吧！
参考文献：
[1] 孙玉松，冯国梧，2017，《“亿元教授”张学礼的背后》，科技日报
[2] Casini, A., et al., 2018. A Pressure Test to Make 10 Molecules in 90 Days: External Evaluation of Methods to Engineer Biology. J. Am. Chem. Soc. 140, 4302–4316.
[3] Choi, K.R., et al., 2019. Systems Metabolic Engineering Strategies: Integrating Systems and Synthetic Biology with Metabolic Engineering. Trends Biotechnol.
[4] Galanie, S., et al., 2015. Complete biosynthesis of opioids in yeast. Science (80-. ). 349, 1095 LP – 1100.
[5] Park, S.-H., et al., 2018. Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for Production of Shinorine, a Sunscreen Material, from Xylose. ACS Synth. Biol.
[6] Ko, Y.-S., et al., 2020. Tools and strategies of systems metabolic engineering for the development of microbial cell factories for chemical production. Chem. Soc. Rev. 49, 4615–4636.
[7] Jens, Nielsen, Jay D, Engineering Cellular Metabolism. Cell, 2016.
策划：李辉 吕雪峰
作者单位：中国科学院青岛生物能源与过程研究所 微生物制造工程中心